2023年11月20日，国际学术期刊Cell Stem Cell杂志在线发表了正序生物与来自上海科技大学、武汉大学、复旦大学、复旦大学附属儿科医院的合作研究团队共同完成的研究成果“Base editing of the HBG promoter induces potent fetal hemoglobin expression with no detectable off-target mutations in human HSCs”，报道了一种基于变形式碱基编辑器tBE的β-血红蛋白病基因治疗新策略。相比较Cas nuclease和Regular BE的基因编辑疗法，该策略可更为精准有效且更加安全地激活γ-珠蛋白表达，为β-血红蛋白病的临床基因治疗提供了新方案。截至目前，正序生物基于该策略开发的首条针对β-血红蛋白病的管线已在动物模型中有超过6个月的安全性验证和有效性观察，计划年内进入临床试验。
β-血红蛋白病是一种严重的人类常染色体单基因遗传病，主要包括β-地中海贫血（β-thalassemia）和镰状细胞病（sickle cell disease）。正常成人血红蛋白HbA（adult hemoglobin, α2β2）是由两条α-珠蛋白链（α-globin chain）和两条β-珠蛋白链（β-globin chain）组成的四聚体。β-血红蛋白病因HBB基因的遗传突变，导致β-珠蛋白生成异常，患者体内缺乏正常的血红蛋白，需要终身输血来缓解症状。全球有超过3%的人口是β-血红蛋白病的携带者，每年有数十万新生儿被确诊。
人的血红蛋白四聚体会随着发育过程发生变化，这个过程被称为“珠蛋白转换（globin switching）”。在胚胎时期，主要由α-珠蛋白和γ-珠蛋白所组成的胎儿血红蛋白HbF四聚体（fetal hemoglobin，α2γ2）进行氧气的输送。胎儿出生后，γ-珠蛋白基因（HBG1/2）被沉默，由β-珠蛋白所取代。HBG1/2的表达沉默受到多种转录因子的调控作用，其中BCL11A和ZBTB7A是其调控网络中两个主要转录抑制因子。已有研究表明，重激活胎儿血红蛋白的表达，可以缓解甚至治愈β-血红蛋白病，HbF的表达水平越高，则β-血红蛋白病的临床缓解程度越好。目前的主要治疗策略，是先收集患者的造血干细胞/祖细胞（hematopoietic stem progenitor cells，HSPCs），在体外通过Cas9核酸酶靶向破坏BCL11A的红系增强子，然后将编辑后的HSPCs重新输入患者体内，即可在患者体内产生表达HbF的正常红细胞，从而达到治疗目的。但此策略仍存在不足之处，Cas9核酸酶会产生DNA双链断裂，因此存在造成HSPCs染色体缺失、异位及细胞周期停滞或细胞凋亡等的安全隐患。另一方面，靶向BCL11A红系增强子是激活HbF表达的间接方式，在某些患者中仍然无法激活高水平的HbF表达。因此，需要进一步探索更安全、更高效重激活γ-珠蛋白的新策略。
在这项最新的研究中，研发团队构建了完善的实验体系，开展了一系列基因编辑靶向位点比较和功能验证的系统研究，证明了一种利用tBE开展β-血红蛋白病基因治疗新方法 （图1）。首先，研发团队在细胞系中对γ-珠蛋白调控网络上下游的六个调控位点进行编辑分析。在所测试的5种胞嘧啶碱基编辑器中， tBE可以在这些调控位点产生高效率的C-to-T突变，且未检测到gRNA依赖性脱靶突变。然后，研发团队探索并优化了tBE的RNA表达系统及电转递送方法，大幅度提高了tBE在HSPCs中的编辑效率。接下来，研发团队将tBE的RNA表达系统递送到HUDEP-2细胞系中，比较编辑不同调控位点所激活产生的γ-珠蛋白表达水平。实验结果表明，通过破坏BCL11A在HBG1/2启动子的结合基序，可在这些实验组中产生最高表达水平的γ-珠蛋白。
图1. 本研究主要步骤示意图
为了更好地证明利用tBE 开展β-血红蛋白病基因治疗的潜力，研发团队在健康人或β0/β0地贫患者来源的HSPCs中将tBE编辑策略与其它临床或临床前基因编辑方法进行了比较，在产生了近乎相同水平编辑效率的条件下，tBE靶向编辑位于HBG1/2启动子的BCL11A结合基序所激活的γ-珠蛋白水平，显著高于Cas9核酸酶靶向BCL11A红系增强子策略。另外，研发团队发现，编辑所产生的突变类型和编辑位点共同决定最终的激活程度。随后，研发团队将编辑后的HSPCs移植到免疫缺陷小鼠中，在移植4个月后检测到tBE编辑的HSPCs可以在小鼠体内重建造血系统，且激活的γ-珠蛋白水平显著高于靶向破坏BCL11A增强子策略（图2）。最后，研发团队对编辑过程中的脱靶事件进行了全面评估。结果证明，经tBE编辑的HSPCs未检测到高于背景水平的DNA/RNA脱靶突变。
图2. 编辑效率和激活HbF水平相关性分析。tBE编辑HBG1/2启动子所激活产生的HbF水平优于现有临床靶向破坏BCL11A增强子策略
综上，该研究证明了通过tBE靶向编辑位于HBG1/2启动子上的BCL11A结合基序，是更为精准有效且更加安全的激活γ-珠蛋白表达的策略，为β-血红蛋白病的临床基因治疗提供了新方案。
正序生物基于该策略开发了首条针对β-血红蛋白病的管线，并且正在全力推进该管线进入临床试验。除此之外，正序生物利用自主创新的碱基编辑技术融合多治疗领域开发了多种创新精准疗法，分别针对遗传疾病、肿瘤、代谢疾病、感染性疾病等布局了近10条管线。正序生物致力于深耕每一条管线并充分了解相关疾病的治疗机制，力争把最高质量、最安全的产品带给患者。相信在不远的将来，正序生物基于变形式碱基编辑技术tBE开发的精准疗法将帮助罹患严重疾病的患者真正实现“一次治疗，终身治愈”的效果。
论文链接：https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(23)00369-7
